CRISPR, una técnica que facilita el estudio del sistema inmune

Durante su estancia posdoctoral en la Universidad de Yale, en el laboratorio del doctor Richard Flavell, la doctora Paula Licona Limón participó junto con un equipo de colegas en una investigación en la que generaron ratones deficientes de las moléculas transformante beta e interleucina 9, utilizando la técnica CRISPR, para estudiar la respuesta inmune de estos animales contra los gusanos. (Foto: AMC/Elizabeth Ruiz Jaimes.)

Durante su estancia posdoctoral en la Universidad de Yale, en el laboratorio del doctor Richard Flavell, la doctora Paula Licona Limón participó junto con un equipo de colegas en una investigación en la que generaron ratones deficientes de las moléculas transformante beta e interleucina 9, utilizando la técnica CRISPR, para estudiar la respuesta inmune de estos animales contra los gusanos. (Foto: AMC/Elizabeth Ruiz Jaimes.)

Zacatecas, Zac.-Todos los organismos, entre ellos las bacterias, el ratón y el ser humano, están expuestos a agentes externos que pueden ser nocivos, por ello han desarrollado mecanismos moleculares de defensa que les permiten combatirlos, y entender cuáles son las bases moleculares responsables de la protección, por ejemplo ante una infección por gusanos, puede contribuir al desarrollo de marcadores de diagnóstico temprano y de inmunoterapias que ayuden a potenciar la respuesta del hospedero contra infecciones.

Para estudiar la respuesta inmune, la doctora Paula Licona Limón, del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, se enfoca en las vías de señalización de dos moléculas, una es el factor de crecimiento transformante beta, relacionado con el sistema inmune, y la interleucina 9, una citoquina producida por los linfocitos-T, y con el fin de conocer su papel en la función o diferenciación de estas células utilizó la técnica CRISPR de edición del genoma, con la que generó ratones deficientes de moléculas relacionadas con ambas vías en un tiempo menor al que requieren otras técnicas.

Durante su estancia posdoctoral en la Universidad de Yale, en el laboratorio del doctor Richard Flavell, la investigadora participó en un estudio en el que identificó una población de linfocitos que expresan interleucina 9, los cuales son importantes en la protección contra los gusanos. Una vez que Licona Limón y los investigadores con quienes trabajó identificaron genes candidatos, que por su nivel de expresión podían ser relevantes para la función de dichos linfocitos, generaron ratones deficientes de las moléculas de interés utilizando la técnica CRISPR.

“Antes de regresar a México logré hacer ratones con pérdida de un fragmento del ácido desoxirribonucleico (ADN) en los genes candidatos de la población de linfocitos que seleccionamos, generé dos tipos de ratones deficientes con el sistema clásico de CRISPR que utiliza la endonuclesa Cas9 silvestre, y también con un sistema modificado que utiliza una endonucleasa mutante llamada nickasa que disminuye la posibilidad de cortar regiones del ADN fuera del blanco”.

De la bacteria a los ratones

CRISPR fue descrito en 1987, cuando al estudiar algunos genes bacterianos se encontraron regiones del cromosoma de las bacterias que iban añadiendo secuencias nuevas. Fue hasta el 2007 que los investigadores entendieron que se trataba del sistema inmune de la bacteria, “es como su carta de vacunación, cada pedazo de ADN en esa región del genoma es de los virus o fagos que han infectado a la bacteria”, dijo la doctora Licona en entrevista para la Academia Mexicana de Ciencias.

Cuando la bacteria es invadida por un virus, algunas de sus enzimas Cas capturan parte del ADN del invasor, lo cortan en fragmentos y los incorporan, separados cada uno por una secuencia repetida en el locus CRISPR, para así tener un “registro” del virus, con lo cual la bacteria queda protegida de reinfecciones posteriores.

Una vez que los científicos entendieron cómo funcionan los diferentes sistemas de CRISPR se adaptó el tipo II, porque al tener una sola endonucleasa (Cas9) es más simple en comparación con otros sistemas que utilizan hasta cuatro distintas endonucleasas. El sistema II depende de la ARN polimerasa II, la endonucleasa Cas9 y de precursores de un ácido ribonucleico (ARN) llamados crARN y tracrARN.

En cuanto a la adaptación de este sistema para su uso en la edición del genoma en organismos pluricelulares y cuya información genética está en el núcleo celular, lo que se hace es conjuntar en un solo ARN, llamado sgARN (ARN guía), las funciones del crARN y del tracrARN.

La información genética de un organismo está en la doble hélice del ADN, formada por dos cadenas de azúcares y fosfato unidas por las bases nitrogenadas que se ordenan en pares de manera específica; es decir, una adenina “A” con una timina “T” y una guanina “G” con una citosina “C”. El ARN guía, conformado por el crARN y tracrARN, ubica la región blanco de veinte nucleótidos de un gen, esta región debe estar aledaña a una secuencia PAM o NGG –en donde la N es cualquiera de los cuatro nucleótidos y la doble GG se refiere a dos guaninas–, además el ARN guía confiere la estructura secundaria para la unión de Cas9 y la especificidad del sitio de corte o modificación del ADN.

Una vez que se introduce el sistema a través de una micro inyección en la célula embrionaria, el ARN guía diseñado de manera específica le indica a la proteína Cas9 la posición de la secuencia a modificar, mientras que al ser esta última una tijera molecular induce un corte en ambas cadenas del ADN. En el caso del sistema modificado que utiliza la endonucleasa mutante nickasa, esta genera un solo corte y se tienen que diseñar pares de ARN guía para dirigir un corte a una cadena del ADN y otro a la complementaria.

A partir de ese momento es tarea de los sistemas de reparación celular introducir una mutación, ya que los cortes de doble cadena generados por Cas9 en el ADN no son un evento usual en la célula. Para reparar el corte existen dos vías, una es la unión de extremos no homóloga y la otra es la vía de reparación dirigida por homología; la primera genera indels (inserción o deleción) que se traducen en mutaciones. “Tenemos mecanismos de reparación que no son perfectos y ante un corte de doble cadena en ocasiones añaden un fragmento de más o quitan uno, entonces esperamos que cuando la célula se dé cuenta del daño lo repare y se equivoque”.

En el caso de la investigación en la que participó la doctora Licona, al introducir en el embrión de una célula un ARN guía y la enzima (sea Cas9 o nickasa), se activaron los dos posibles sistemas de reparación, y a los veintiún días nacieron ratones modificados. “Al analizar la secuencia de veinte nucleótidos que nos interesa y que modificamos en diez ratones, identificamos que la reparación al azar por unión de extremos no homóloga provocó deleciones únicas en cada ratón, que se traducían en problemas en la transcripción, generando una proteína truncada”, explicó.

Ya con los ratones modificados, lo que le interesa estudiar a la científica es si el gen candidato que se eliminó con el sistema de CRISPR/Cas9 es importante para la biología de la población de linfocitos T, que expresan interleucina 9, y que protegen al ratón contra gusanos, para en un futuro y tras diversos estudios poder extrapolar este conocimiento al ser humano.

Además de la doctora Licona Limón, quien pronto contará con el equipo necesario para trabajar con CRISPR en su laboratorio del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, los doctores Félix Recillas Targa, Fernando López Casillas y Rosa Navarro González han incorporado a sus líneas de investigación el uso de la técnica CRISPR, cada uno con un modelo de estudio diferente.

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